PCR (raziskava) - uporaba. Kaj je tehnika PCR?

PCR je test, ki je bil uporabljen pri diagnozi številnih bolezni. Metoda PCR omogoča prikaz neposredne prisotnosti bakterij v organizmu, natančneje njegove DNK. PCR se med drugim uporablja pri diagnozi borelioze. Kaj je tehnika PCR? Kaj je PCR v realnem času?

Kazalo:

1. PCR (testiranje) - kaj je tehnika PCR?
2. PCR (raziskave) - uporaba metode PCR
3. PCR (raziskave) - borelioza
4. PCR (raziskave) - rezultati. Ali so lahko lažno pozitivni?
5. PCR (raziskave) - rezultati. Ali so lahko lažno negativni

PCR (verižna reakcija s polimerazo) je osnovna metoda, ki se uporablja v genetskih in molekularnih laboratorijih. Leta 1983 ga je razvila Kara Mullis, ki mu je leta 1993 podelila Nobelovo nagrado.

Poslušajte, kaj sploh je tehnika testiranja PCR. To je gradivo iz cikla POSLUŠAJ DOBRO. Podcasti z nasveti.

Če si želite ogledati ta video, omogočite JavaScript in razmislite o nadgradnji na spletni brskalnik, ki podpira video

PCR (testiranje) - kaj je tehnika PCR?

PCR testiranje je sestavljeno iz večkratnega pomnoževanja (običajno 30-40 ciklov) določenega fragmenta DNA, na primer genov, ki kodirajo protere borelije, z uporabo encima polimeraze.

Nato s posebnimi molekularnimi barvili postanejo ojačani fragment DNA vidni. PCR je zaradi pomnoževanja specifičnih fragmentov DNA ultra občutljiva metoda.

Pri PCR metodi se fragmenti DNA pomnožijo z uporabo posebnih parov primerjev za določeno regijo bakterijske DNA. Na primer, ciljne regije v PCR, ki se uporabljajo pri diagnozi borelioze, so geni, ki kodirajo proteine, npr. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Biološki material, iz katerega je mogoče izvesti preskus, je:

• kri
• del kože iz migrirajočega eritema
• cerebro-spinalna tekočina
• sinovialne tekočine ali iz sklepnega hrustanca
• urin

PCR (raziskave) - uporaba metode PCR

Poleg diagnoze lymske borelioze s pomočjo metode PCR je mogoče odkriti specifične fragmente DNA drugih mikroorganizmov ali ljudi. Zato se metoda PCR uporablja tudi pri:

• diagnostika in spremljanje virusnih okužb: virusi herpesa (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovirus), HIV, virusi hepatitisa (HBV in HCV)
• diagnostika in spremljanje bakterijskih okužb, zlasti tistih bakterij, ki jih ni mogoče prepoznati s kulturo, npr. tuberkuloze
• diagnostika in spremljanje neoplastičnih bolezni: levkemije, rak dojke, kolorektalni rak, pljučni rak
• diagnoza nagnjenosti k raku: rak dojke in jajčnikov (geni BRCA1 in BRCA2), kolorektalni rak (geni APC in CHEK2)
• diagnostika genetskih bolezni: hemokromatoza (gen HFE), talasemija (geni HBA1 in HBA2), celiakija (geni HLA)
• testi očetovstva, ki zaznajo združljivost DNK otroka in očeta

Preberite tudi: Testi za Lymsko bolezen - kako izgledajo in kakšna je cena testov za Lymsko bolezen Western Blot test in Lymeova bolezen. Razlaga rezultatov testa Klopne bolezni: Lymska bolezen, babezioza, bartoneloza, TBE in drugi.

Trenutno obstaja veliko sprememb metode PCR. Na primer, pri diagnozi lymske borelioze se uporabljajo predvsem metode ugnezdenega PCR (ugnezdeni PCR) in PCR v realnem času. Slednja je kvantitativna metoda in omogoča določanje natančnega števila kopij borelijske DNA v testiranem biološkem materialu.

PCR (raziskave) in borelioza

Serološki testi so osnova za diagnozo borelioze. Vendar obstajajo klinične situacije, ki lahko povzročijo, da so ti testi lažno negativni:

• začetno obdobje okužbe, v katerem telo še ne proizvaja specifičnih protiteles IgM in IgG proti spirohetam Borrelia
• pri ljudeh z imunsko pomanjkljivostjo, ki ne proizvajajo dovolj protiteles
• prisotnost imunskih kompleksov, ki so sestavljeni iz antigenov borelije in zanje specifičnih protiteles, in preprečujejo odkrivanje protiteles s serološkimi metodami

Če pri bolniku sumimo na simptome lymske borelioze in so rezultati seroloških preiskav negativni, je mogoče opraviti molekularno testiranje na osnovi metode PCR.

DNA spirohet borelije je mogoče odkriti v zgodnji fazi okužbe, saj je število spirohet v telesnih tekočinah takrat največje.

Pri diagnozi lymske borelioze se v glavnem uporabljajo serološke metode, kot je ELISA, vendar so v nekaterih kliničnih situacijah koristni genetski testi z uporabo metode PCR.

Daljši kot je čas od okužbe, manj verjetno je, da odkrijejo bakterijsko DNA. Zato v nekaterih primerih pred izvajanjem PCR testa bakterije gojijo na posebnih medijih 1-2 tedna in nato opravijo test.

Ta pristop se uporablja v primeru suma na lymsko boreliozo in odvzeto likvor. V pozni fazi okužbe je primerneje opraviti test ELISA.

Metoda PCR se ne sme uporabljati pri rutinski diagnozi borelioze Lyme zaradi pomanjkanja standardizacije glede pojavljanja sort Borrelia burgdorferi na Poljskem.

Vendar pa v primeru težav pri diagnozi (zlasti v zgodnji fazi bolezni) rezultat testa PCR pomaga pri diagnostičnem procesu.

Pozitiven rezultat testa pomeni, da je bila v testiranem materialu zaznana prisotnost DNK Borrelia burgdorferi DNA in njenih sort, vendar ne pojasnjuje, ali v telesu prihaja do aktivne okužbe. Po drugi strani pa negativni rezultat ne izključuje prisotnosti bakterij v telesu.

Nekateri laboratoriji ponujajo testiranje na prisotnost DNA borelije v klopu. Rezultat takšnega pregleda pa ni osnova za diagnozo lymske borelioze pri ugrizni osebi.

Priporočen članek:

Test ELISA - kaj zazna? Kako prebrati rezultate? Cena testa

PCR - rezultati. Ali so lahko lažno pozitivni?

PCR je ultra občutljiva metoda in hkrati zelo občutljiva na kontaminacijo. Zato je pri testih, ki temeljijo na PCR, zelo pomembno, da izberemo ustrezen notranji nadzor, da izključimo lažne pozitivne rezultate.

Ključno je tudi pravilno zbiranje materiala za testiranje ter izkušnje in zanesljivost diagnostika, ki opravlja test.

PCR - rezultati. Ali so lahko lažno negativni

Kot pri katerem koli laboratorijskem testu se lahko tudi pri PCR metodi pojavijo lažno negativni rezultati. Tu je ključnega pomena zbiranje krvi za ustrezen antikoagulant, saj lahko nekateri od njih, na primer heparin, zavirajo reakcijo PCR.

Tudi zbiranje materiala po začetku antibiotične terapije lahko povzroči zmanjšanje učinkovitosti reakcije PCR in večjo verjetnost lažno negativnih rezultatov.

Ne smemo pozabiti tudi, da bakterije borelije zelo kratek čas živijo v krvi in ​​telesnih tekočinah, saj po zaslugi posebnih receptorjev zelo hitro prodrejo na "težko dostopna" mesta v telesu.

Zato je v nasprotju z diagnostiko drugih mikroorganizmov število spirohet borelije v biološkem materialu majhno, včasih celo na meji zaznave metode PCR. To lahko povzroči tudi lažno negativno.

Priporočen članek:

Preskus preoblikovanja limfocitov (LTT)

Literatura

1. Dunaj J. et al. Pomen metode PCR pri diagnozi lymske borelioze. Brskaj Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
2. Laboratorijska diagnoza bolezni, ki se prenašajo s klopi. Priporočila delovne skupine: Nacionalna zbornica laboratorijskih diagnostikov, Nacionalni inštitut za javno zdravje-Nacionalni inštitut za higieno, nacionalni svetovalec na področju nalezljivih bolezni, Oddelek za nalezljive bolezni in nevroinfekcije, Medicinska univerza v Białystoku, Poljsko društvo za virusologijo, Varšava 2014.
3. Ružić-Sabljić E. in Cerar T. Napredek pri molekularni diagnozi borelioze. Strokovnjak Rev Mol Diagn. 2017 januar; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Načela in uporaba verižne reakcije s polimerazo na področjih medicinske diagnostike: pregled. Braz J Microbiol. 2009 januar-marec; 40 (1): 1–11.

O avtorju

Karolina Karabin, dr. Med., Molekularni biolog, laboratorijski diagnostik, Cambridge Diagnostics Polska Biolog s specializacijo iz mikrobiologije in laboratorijski diagnostik z več kot 10-letnimi izkušnjami v laboratorijskem delu. Diplomant šole za molekularno medicino in član poljskega Društva za človeško genetiko, vodja raziskovalnih štipendij v Laboratoriju za molekularno diagnostiko na oddelku za hematologijo, onkologijo in notranje bolezni Medicinske univerze v Varšavi. Na 1. medicinski fakulteti Medicinske univerze v Varšavi je zagovarjala naziv doktorice medicinskih znanosti s področja medicinske biologije. Avtor številnih znanstvenih in poljudnoznanstvenih del s področja laboratorijske diagnostike, molekularne biologije in prehrane. Vsak dan kot strokovnjak na področju laboratorijske diagnostike vodi vsebinski oddelek pri Cambridge Diagnostics Polska in sodeluje z ekipo nutricionistov na dietetični kliniki CD. Svoje praktično znanje o diagnostiki in dietni terapiji bolezni deli s strokovnjaki na konferencah, izobraževanjih ter v revijah in spletnih straneh. Zanima jo predvsem vpliv sodobnega življenjskega sloga na molekularne procese v telesu.